第三章：实时荧光定量PCR的应用

一、相对定量

在不同样品中测定基因表达量的相对值时，内参基因的选择至关重要。建议遵循以下原则：

• (1) 选择表达丰盈且稳定的基因作为内参基因。
• (2) 避免盲目选择常用的内参基因。
• (3) 常见的内参基因有：GAPDH、Actin和Tublin。

合适的内参基因选择将决定结果的可靠性，加入内参基因后即可进行结果的计算。

二、绝对定量

通过标准品来测定样品中基因表达量的绝对值（拷贝数）是另一种方法。标准品主要包括：

• A/明确拷贝数浓度的克隆质粒
• B/PCR产物
• C/cDNA（需测定扩增效率，绝对定量时不可使用）

计算拷贝数时，可以采用以下公式：

拷贝数计算平均分子量(MW)：

• dsDNA = (碱基数) x (660道尔顿/碱基)
• ssDNA = (碱基数) x (330道尔顿/碱基)
• ssRNA = (碱基数) x (340道尔顿/碱基)

拷贝数计算公式为：

(6.02 x 10²³ 拷贝数/摩尔) x (浓度 g/ml) / (MW g/mol) = copies/ml

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